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iTRAQ/TMT標記定量蛋白質組研究

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iTRAQ/TMT標記定量蛋白質組研究是對一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜混合體系內所有蛋白質進行標記,利用標記試劑中的二級報告離子來對蛋白進行精確鑒定和定量。
 
標記試劑分為兩種:iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags),是分別由美國AB Sciex公司和Thermo公司研發的多肽體外標記定量技術,采用多種同位素的標簽,可與氨基(包括氨基酸N端及賴氨酸側鏈氨基)反應實現連接,通過高精度質譜分析,同時實現多個樣本蛋白組的定性和定量。
 
標記試劑與原理:
 
蛋白質組學
備注:
Reporter: 報告離子基團,用來對不同肽段進行定量; 
Balance:平衡基團,保證同一肽段標記后母離子質量一致;
Peptide Reactive Group:肽反應基團,與氨基酸N端及賴氨酸側鏈氨基反應連接。
 
標記試劑盒種類:
 
蛋白質組學
 
iTRAQ/TMT技術研究流程:
 
蛋白質組學
 
生信分析展示:
 
蛋白質組學
 
技術優勢:
 
適用范圍廣:可檢測到的蛋白除了胞漿蛋白外,還有線粒體蛋白、膜蛋白和核蛋白。也能對任何類型的蛋白質進行鑒定,包括高分子量,酸性,堿性蛋白質;
 
高通量:一次可以實現多個樣品的定性定量分析,特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析;
 
結果可靠:基于高靈敏度和高分辨的串聯質譜方法,定性與定量同步進行,同時得出定性和定量結果,重復樣品間的蛋白表達量相關性高;
 
靈敏度高:分級分離,降低樣品復雜度,相比凝膠電泳觀測到的蛋白變化在2倍以上,iTRAQ計算出的蛋白變化在1.3-1.6倍之間,可檢測低豐度蛋白;
 
分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白,小于10KDa或大于200KDa的蛋白、難溶性蛋白等;
 
自動化程度高:液質聯用,自動化操作,分析速度快,分離效果好。
 
技術參數:
樣本要求:
動物及臨床組織標本    100 mg/sample、
血清、血漿          200μL/sample
細胞 、微生物        1×107 cells/sample
植物嫩葉、嫩芽       500mg/sample
植物種子           200mg/sample
植物果肉           20g/sample
 
儲存和運輸:
 
液氮或-80℃保存;足量干冰運輸,避免反復凍融。
 
檢測平臺:
 
蛋白質組學
 
應用方向:
 
蛋白組學
 
案例分享:
 
Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue
應用TMT技術研究由于年齡和高脂飲食引起的小鼠附睪脂肪組織蛋白質組的變化 
研究內容:小鼠附睪脂肪組織的TMT蛋白質組學
發表期刊:Molecular & Cellular Proteomics
影響因子:IF=6.54
研究背景:
肥胖癥是一種世界性流行病,與代謝并發癥如2型糖尿病、高血壓、血脂異常和動脈粥樣硬化的發病率增加有關。過去由于缺乏有效的高通量技術手段限制了對附睪組織的整個白色脂肪組織蛋白質組變化的研究。因而作者利用多組高通量TMT標記定量蛋白組技術對小鼠附睪組織的蛋白質組進行了深入的研究。
實驗樣本:
將20只8周齡的小鼠進行低脂或高脂飲食的喂養,時間為短(8周)或長(18周)(每個實驗組5只小鼠)。收集附睪脂肪,溶解,取100mg進行胰蛋白酶消化。用TMT-10plex標記樣品和pool樣本,合并上機后分為9個餾分。 報告離子強度使用內部參考標度(IRS)進行標準化。差異表達的蛋白質通過edgeR的篩選來確定,并通過基因富集和網絡分析進行表征。
實驗策略:
采用了三組TMT-10-plex試劑盒進行標記。
分析軟件:
Proteome Discoverer(1.4.1.14 version,Thermo Scientific), SEQUEST
分析策略:
Volcano plots ,Pearson correlation, Network analysis, Gene Enrichment
 
蛋白質組學
 
部分應用文獻:
[1] Pengjun Jiang, Jun Wu, Xin Chen,et al.Quantitative proteomics analysis of differentially expressed proteins in ruptured and unruptured cerebral aneurysms by iTRAQ[J]. J Proteomics,2018,45-52.
[2] Fei Ge, Hongmei Hu, Xing Huang,et al. Metabolomic and Proteomic Analysis of Maize Embryonic Callus induced from immature embryo[J]. J Proteomics,2017,1004.
[3] Yong Xie, Yanpan Gao, Licheng Zhang,et al. Involvement of serum-derived exosomes of elderly patients with bone loss in failure of bone remodeling via alteration of exosomal bone-related proteins [J]. Aging Cell, Volume17, Issue3.
[4] Ying Liu, Yajing Fu, Qian Wang,et al. Proteomic profiling of HIV-1 infection of human CD4+ T cells identifies PSGL-1 as an HIV restriction factor [J]. Nature Microbiology 4,813–825.
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iTRAQ/TMT標記定量蛋白質組研究
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